【发布部门】农业部【发文字号】农政发[2004]1号【发布日期】2004.02.03【实施日期】2004.02.03【效力级别】部门规范性文件
第一项 样品采集、保存及运输技术规范
采集、保存和运输样品应当符合下列要求，并填写采样单。
一、样品采集
（一）病禽
1．至少从5只濒死禽采集样品。样品包括：泄殖腔拭子和气管拭子（置于缓冲液中）各5个（小珍禽可采集新鲜粪便）；气管和肺的混样5个，肠管及内容物的混样5个；肝、脾、肾和脑等组织样品（不能混样）各5个。
2．分别采集至少10个病鸡的血样（急性发病期血清）。
（二）病死禽
无发病禽时，可从死亡不久的病禽采样，采样要求同病禽。
棉拭子单独放入容器，容器中盛放含有抗菌素的ph值为7.0－7.4的PBS液。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中加入青霉素（2000IU/mL）、链霉素（2mg/mL）、庆大霉素（50μg/mL）、制霉菌素（10000IU/mL）。但粪便和泄殖腔拭子所用的抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后ph值应调至7.0－7.4。
二、样品保存和运输
血样要单独存放，不能混合。
样品应密封于塑料袋或瓶中，置于有制冷剂的容器中运输，容器必须密封，防止渗漏。
样品若能在24小时内送到实验室，冷藏运输。否则，应冷冻运输。
若样品暂时不用，则应冷冻（最好－70℃或以下）保存。
采样单
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┃样品名称 │ ┃
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┃样品编号 │ ┃
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┃采样基数 │ │ 采样数量 │ ┃
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┃采样日期 │ │ 保存情况 │ 冷冻（藏） ┃
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┃被采样单位 │ ┃
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┃通讯地址 │ ┃
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┃联系电话 │ │ 邮编 │ ┃
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┃ │ │ │ ┃
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┃被采样单位盖章或签名 │ 采样单位盖章 采样人签名 ┃
┃ │ ┃
┃ 年月日 │ ┃
┃ │ 年月日 ┃
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┃备注： ┃
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此单一式三份，第一联存根，第二联随样品，第三联由被采样单位保存
第二项 血清学诊断技术规范
一、血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验技术
（一）材料准备
1. 96孔V型微量反应板，微量移液器（配有滴头）。
2. 阿氏（Alsevers）液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录A。
3. ph7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）。
4. 高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。
（二） 操作方法
1. 血凝（HA）试验（微量法）
（1）在微量反应板的1－12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。
（2）吸取0.025mL抗原加入第l孔，混匀。
（3）从第1孔吸取0.025mL抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。
（4）每孔再加入0.025mL PBS。
（5）每孔均加入0.025mL 1%（V/V）鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。
（6）振荡混匀，在室温（20℃－25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下1hr）。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。
（7）结果判定。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。
2. 血凝抑制（HI）试验（微量法）
（1）根据血凝试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。
（2）在微量反应板的1－11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。
（3）吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。
（4）1－11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20℃）静置至少30min。
（5）每孔加入0.025mL的鸡红细胞悬液轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下1hr），对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔底。
（三）结果判定
以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。
只有阴性对照孔血清滴度不大于21og 2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于31og2判定HI试验阴性；HI价等于41og
2为阳性。
二、琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验
（一）材料准备
1. 硫柳汞溶液、ph7.2的0.01mol/L PBS溶液，配制方法见附录B。
2. 琼脂板：制备方法见附录C。
3. 禽流感琼脂凝胶免疫扩散抗原、标准阴性和阳性血清。
（二）操作方法
1.
打孔。在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔（中间1孔，周围6孔），孔径约5mm，孔距2mm－5mm，将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。
2. 封底。用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要溶化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。
3.
加样。用微量移液器或带有6～7号针头的0.25mL注射器，吸取抗原悬液滴入中间孔（图1的⑦号），标准阳性血清分别加入外周的①和④孔中，被检血清按编号顺序分别加入另外4个外周孔（图1的②，③，⑤，⑥号孔）。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头。
4. 作用。加样完毕后，静置5min～10min，然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内，37℃温箱中作用，分别在24h、48h和72h观察并记录结果。
（三）结果判定
1. 判定方法。将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清（图1的①和④号孔）与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。
2. 判定标准
（1）若被检血清孔（如图1中的②号）与中心抗原孔之间出现清晰致密的沉淀线，且该线与抗原与标准阳性血清之间沉淀线的末端相吻合，则被检血清判为阳性。
（2）被检血清孔（如图1中的③号）与中心孔之间虽不出现沉淀线，但标准阳性血清孔（如图1中的④号）的沉淀线一端向被检血清孔内侧弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性（凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性）。
（3）若被检血清孔（如图1中的⑤号）与中心孔之间不出现沉淀线，且标准阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。
（4）被检血清孔（如图1中的⑥号）与中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊或标准阳性血清与抗原孔之间的沉淀线交叉并直伸，被检血清孔为非特异反应，应重做，若仍出现非特异反应则判为阴性。
图1 AGP试验结果（略） | 
